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利用细胞评价供试品保湿功效 

【实验原理】

皮肤是我们身体中最大的器官，具有各种不同的复杂功能。它由三个不同的层组成:表皮、真皮和皮下组织。表皮是皮肤的最外层，作为抵御环境损害的屏障，包括压力、微生物和辐射。此外，表皮也作为机体保湿的重要防线，目前机体保湿程序可以分为被动保湿和主动保湿，两者相互协调共同保障皮肤角质层的水合程度。其中天然保湿因子（NMF）是具有吸水特性的小分子复合物，由透明质酸和丝聚蛋白组成，能够有效吸收并锁住水分，配合防护角质细胞结构，强化锁水屏障。而其中水通道蛋白（AQP3）表达于表皮基底层的角质形成细胞，可以转运水、甘油和尿素到达表皮，促进角质层的水合作用，是维持皮肤水合作用的一个关键因素。综上，本实验拟通过检测样品处理下角质形成细胞中FLG和AQP3基因相对表达量以及HA含量来评价样品否具有保湿功效。

【实验方法】

实验一：MTT法检测样品对HaCaT的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1 × 10^4个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。

4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。

OD490：490 nm处的吸光度值

实验二：样品处理后HaCaT的FLG和AQP3基因表达

1) 细胞接种：将HaCaT以6 × 10^5个/孔接种于6孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置对照组（X mJ/cm2+0 mM样品）、低浓度组（X mJ/cm2+A mM样品）、中浓度组（X mJ/cm2+B mM样品）、高浓度组（X mJ/cm2 + C mM样品）。

2)给药：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h；

3）孵育结束后，D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次，正常对照组加入新鲜培养基，样品组加入含相应浓度的样品新鲜培养基，37 ℃，5% CO2培养24 h。 

4）培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。

5）用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。

实验三：样品处理后HaCaT的HA含量测定

1.细胞接种：接种细胞于12孔板内（3 × 105 个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。

2.给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。

3.收样检测：孵育结束后，每孔收集300 μL细胞培养上清，ELISA法检测透明质酸含量。

【评价指标】

FLG和AQP3基因表达、HA含量

【评价结论】

与对照组相比，实验组FLG和AQP3基因表达以及HA含量均具有显著性上调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有保湿功效。

【参考文献】

[1] You L, Kim MY, Cho JY. Protective Effect of Potentilla glabra in UVB-Induced Photoaging Process. Molecules. 2021 Sep 6;26(17):5408.

[2]王静.枸杞提取物对UV诱导皮肤光损伤的保护作用及机制研究[D].广东工业大学.

[3]张荣鑫.N-乙酰葡萄糖胺对皮肤角质形成细胞透明质酸合成的影响[D].大连医科大学, 2007.

[4]范丽云.维生素C对体外培养的人皮肤成纤维细胞HAS-2,MMP-1基因表达的影响[C].天津医科大学.《天津医科大学》,2009.