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项目一：屏障修护功能相关基因表达测定
【实验原理】
角质形成细胞在向上分化形成皮肤屏障的过程中，各种结构基因会不同程度地表达，翻译出蛋白并特异性分布在皮肤的各层中。与皮肤屏障功能密切相关的蛋白主要由细胞与细胞间的紧密连接蛋白和细胞与基质间的锚定连接蛋白有关。而上述紧密连接蛋白中主要以有闭合蛋白（occludin）、密封蛋白（claudin)、连接粘附分子（JAM) 和 闭合小环蛋白（ZOs）为主。包括板层素（Laminin）、IV型、VII及XVII胶原蛋白又是组成锚定连接蛋白组分。本实验利用人永生化角质形成细胞（HaCaT），将样品作用于细胞后检测紧密连接蛋白和锚定连接蛋白基因相对表达量，来评估样品的屏障修护功效。
【实验步骤】
实验一：MTT法检测某化妆品对HaCaT的细胞毒性实验
1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1×10^4 个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。
2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。
4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。
OD490：490 nm处的吸光度值
实验二：屏障修护功能相关基因表达测定
1）细胞接种：接种HaCaT细胞于6孔板中，每孔6 × 10^5个，37 ℃，5% CO2培养24 h。
2）给药：孵育结束后，D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次，正常对照组加入新鲜培养基，样品组加入含相应浓度的样品新鲜培养基，37 ℃，5% CO2培养24 h。
3）收样及检测：培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。
4）数据分析：用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。
【评价指标】屏障修护功能相关基因表达测定
【评价结论】
供试品组与对照组相比屏障修护功能相关基因表达上调且具有显著性差异（P＜0.05），初步证明该样品具有修护功效。
【参考结论】
[1] Anna Dębińska, Matteo Megna, New Treatments for Atopic Dermatitis Targeting Skin Barrier Repair via the Regulation of FLG Expression[J]. J Clin Med. 2021,10(11): 2506.
[2] 杜洪振, 孙钦秀, 杨振,等. 转谷氨酰胺酶对鲤鱼肌原纤维蛋白乳化活性和凝胶特性的影响[J].食品工业科技, 2019, 40( 6) : 126-130,278.
项目二：利用细胞划痕实验评价供试品的皮肤屏障修复功效
【评价原理】
随着年龄的增加，皮肤接受外来环境（物理损伤，化学试剂等）的影响，造成皮肤的日益老化，在老化的过程中，细胞的损伤逐渐积累，进一步加速了皮肤老化。人皮肤角质形成细胞（human immortalized keratinocytes, HaCaT）是构成皮肤表皮层的主要细胞类型，并且具有表皮构成、创伤修复、细胞角化、细胞因子分泌和免疫监视等功能，常被用于生物医学领域作为体外皮肤研究的细胞系，例如皮肤修复愈合和防晒等，在伤口愈合的早期阶段，表皮中角化形成细胞被激活，并迁移到创伤部位诱导伤口收缩，接着进行细胞增殖以皮肤修复重建。因此，角质形成细胞对于伤口愈合有重要作用。利用人永生化角质形成细胞HaCaT建立划痕实验模型，检测供试品是否对细胞具有屏障修护的功效。
【实验方法】
将对数生长期的HaCaT消化重悬后进行计数，接种6×10^5个细胞/孔培养（37℃、5%CO2、24h），分别设置空白组、阳性对照组和样品组。待细胞100%融合后，用枪头比着载玻片，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。划痕结束后，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，对照组加入1%血清培养基，阳性对照组加入含100ng/ml EGF的1%血清培养基，实验组加入含一定浓度受试物的1%血清培养基。放入37度5%CO2培养箱，培养。按0和24小时取样，拍照，计算愈合率：
【评价指标】HaCaT细胞修复愈合率
【评价结果】样品组给药24 h后的划痕面积与正常对照组相比，明显减少，揭示了该样品具有修护功效。
【参考文献】
[1] 王怀玲,董栋,邹沐平,廖晓凤,刘秋英,王一飞.琼枝麒麟菜多糖超声提取工艺及皮肤修复活性研究[J].中国海洋药物,2014,33(06):65-70.
[2] 刘成星,李晓娜,冯鹏飞,安美文,陈维毅.机械拉伸对兔角膜成纤维细胞增殖和迁移的影响[J].太原理工大学学报,2014,45(01):138-142.
[3] Lim M, Goldstein MH, Tuli S, Schultz GS. Growth factor, cytokine and protease interactions during corneal wound healing. Ocul Surf. 2003 ;1(2):53-65.
